干货分享|快速了解什么是实时荧光定量PCR

定义

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR),简称qPCR,是一种在DNA扩增体系中加入荧光基团,通过聚合酶链式反应(PCR)循环实现荧光信号的积累,从而实时检测每次PCR循环后产物总量的一种方法,是核酸检测和定量分析的“金标准”。

化学原理

实时荧光定量PCR根据所使用的荧光化学可分为两种:荧光染料(SYBR Green I染料)和荧光探针(TaqMan探针)。

1.荧光染料(非特异性标记)

SYBR Green I染料是一种结合于所有双联DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时,发出的荧光极其微弱,但当其与DNA双链结合的时候,荧光信号就会被放大,从而被仪器所检测。在PCR实验中,染料的结合量与DNA双链的浓度呈现正比关系,所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反应PCR体系中DNA的浓度。

干货分享|快速了解什么是实时荧光定量PCR插图

优点:可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增,无需单独设计探针,操作简单成本较低。

2.荧光探针(特异性标记)

TaqMan荧光探针是进行荧光检测的另外一种方法。TaqMan荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3’端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时,荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收,但当PCR进行到退火、延伸阶段时,DNA聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离,从而发出荧光,因此探针法也可以通过检测荧光信号的强度来反应PCR体系中DNA的浓度。

干货分享|快速了解什么是实时荧光定量PCR插图1

优点:①荧光探针只与目的序列结合,具有良好的特异性,无须实验优化

②不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针,兼容多重反应

常见术语

CT值:C代表Cycle,T代表Threshold,即指qPCR在扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。

扩增曲线:Amplification curve ,随着PCR反应的进行,荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强,通过荧光强度来检测扩增产物的变化。

阈值Threshold,自动设置是3-15个循环的荧光信号平均值的标准偏差的10倍,也是基线标准偏差的10倍。

惰性参比染料(ROX):用作荧光信号标准化内部参照,可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。

溶解曲线:Melting curve,是指扩增反应结束后,对双链DNA进行升温处理,此时,DNA双链逐渐解开,染料脱落,荧光值下降,荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”,可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。

扩增效率:一个DNA分子扩增为2个DNA分子,这种情况下的扩增效率为100%。实际上会出现偏高和偏低的情况,90-110%之间。

NTC:无模板对照(No template control),是指扩增反应中,模板通常用水来代替,用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染。

 

实验操作步骤

1实验试剂耗材的准备:包括DNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O、qPCR仪、移液枪、无酶枪头等。

2配制qPCR反应体系,用枪头轻轻混匀。

 

组分 体积(μL) 体积(μL) 终浓度
qPCR酶 10 25
引物F 0.4 1 0.2μM
引物R 0.4 1 0.2μM
模板DNA X X /
ddH2O 补足至20 补足至50 /

 

注:①推荐在冰上配制qPCR反应体系。

②引物浓度通常为0.2μM,可根据实验实际情况进行调整。

③推荐使用20或50μL的反应体系,可保证扩增的有效性。

④如果模板DNA为未稀释的原液,建议使用体积不超过反应体系体积的1/10。

3上机反应上机前设置样本信息和程序,上机前的样品需轻微离心,避免气泡,加完样品后,立马上机。

4导出数据,实验分析常见的计算公式包括:△CT= CT(目的基因)- CT(内参基因);△△ CT= △CT(实验组)- △CT(对照组);RQ=2^-△△CT

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