干货分享 | 湿式转印技术简介

电印迹技术一直是最常见的把蛋白质从凝胶转移到薄膜的方法。与其他早期技术相比,其主要优点是速度快,以及能够保证转移的完全性。

在实现方面,它可以通过在缓冲液完全浸入凝胶及膜的三明治结构的湿式转印通过将凝胶和膜的夹层放置在浸泡过转移缓冲液的吸水介质之间进行转移的半干式转印来达成。

对于湿式转移的基本要求是将三明治结构放置在带有铂丝电极的缓冲器皿内进行(图1)。有许多不同的仪器可以将蛋白质(或其他大分子)从凝胶横向转移到膜上。这其中大部分的仪器都是基于托宾的设计 (Towbin al.1979):也就是将垂直的不锈钢/铂电极置于在一个大槽内。

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通常的情况下用于转印的聚合物膜在阳极一侧,但这不是绝对的,对于某些特殊形式的转印,蛋白或其他大分子物质会向阴极移动,这时膜应在阴极一侧。

目前实验室常用的湿式转印槽,其外槽通常为有0.5-10L容量的塑料器皿,并有专门的结构可以放置并固定内槽或组件,配有冷却装置。其电极为曲折缠绕的金属线或板式电极,电极反向于三明治结构的一面通常都被很仔细的包覆起来,跟外部缓冲液隔开,以避免不必要的电流损失,电极通常通过内槽上的结构与外部电源相连接。整体式的内槽下端为开放式,通常支持放入多个转印用三明治组件。金属线的直径及板式电极的厚度通常在0.2-2mm之间,两极的间距通常大于4cm。阳极的材质选择为铂,钛,铑或其合金,阴极的选择除了以上几种还可以选择一些耐腐蚀的金属材料,如不锈钢。对于无整体内槽结构的湿转槽,通常会将各组件分别插入外槽,包括三明治结构,电极,冷却结构。

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作为这样设计的最大优点在于有足够的大的容积可以容纳缓冲液及冷却用冰盒,在长时间的转印中可以有效的控制温度。在三明治组件的放置部位与其他部分可以通过缓冲液的对流来达到局部冷却目的。当然这种方式的缺点也很明显,对于整体的槽式设计无法将阴极液和阳极液分离,阳极和阴极的缓冲介质会混合在一起,从而无法通过高电流达到快速转移的目的,通常湿式转印都需要有一定的时间限定。

最经典的托宾式湿式转印配方为:25mM Tris,192mM Glycine,1mM EDTA,10-20%甲醇。通常情况下不需要调节pH值,pH值在8.3附近。

对于缓冲介质的选择阳离子缓冲介质通常为有机胺类缓冲剂,主要包括Tris(三羟基甲氨基甲烷),Bis-tris(二(2-羟乙酸)亚胺基三(羟甲基)甲烷),Bis-Tris Propane(双[三(羟甲基)氨基丙烷]),TEA(三乙醇胺),其浓度通常为20-200mM(毫摩尔每升)。阴极离子缓冲介质的主要成分是两性缓冲剂,可以包括 Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸),HEPES(2-羟乙基哌嗪乙磺酸),Glycine(甘氨酸),6-氨基己酸,BES(N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸),CAPS(3-(环已基)-1-丙磺酸)其中的一种或多种的混合溶液,浓度为20-200mM(毫摩尔每升)。也可以选择商品化的转印缓冲液。

两极缓冲液均需加入一定成分的有机溶剂,主要包括甲醇,乙醇,2-丙醇。加入有机试剂的目的在于防止凝胶的膨胀,以减少低分子量蛋白的流失。

对于高分子量的蛋白通常的转移效率较低,可以通过在缓冲液里添加一定量的阴离子表面活性剂来增加效率,一般选择十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸锂,其量一般不超过0.1%。当然对于在转印过程是否可以添加阴离子表面活性剂存在很大的争议,反对方通常认为表面活性剂会影响蛋白的活性。如果实验中很需要关注蛋白的活性,可以选择延长转印时间或采用别的转印方式来避免加入表面活性剂。

转印所使用的聚合物膜,通常有三种,分别为硝酸纤维素膜(NC),偏聚二氟乙烯(PVDF)和尼龙膜。通常尼龙膜不作为首选。NC膜具有良好的亲水型而且价格便宜,其载量和吸附性能较PVDF膜低;PVDF膜亲水性较差,在使用之前需要在甲醇或其他有机溶剂中激活,其载量和吸附性能较NC高。对于这两种膜,通常有0.45um和0.22um的孔径规格,对于小于20KD的蛋白不宜选择0.45um规格,这会导致蛋白透膜而损失。

在凝胶的选择上通常会优先依照蛋白分子量的分辨范围选择,但是需要指出的是,对于相同分子量的蛋白在固定浓度的聚丙烯酰胺凝胶上的条带,浓度越高则转印的效率越低,其原理不难理解,凝胶的多孔结构越致密蛋白的迁移越困难则转移效率越低。所以对于高分子量的蛋白通常需要更低浓度的聚丙烯酰胺凝胶。当然在这一点上也有特别合适的选择,就是梯度聚丙烯酰胺凝胶。基于此类凝胶基本的浓度梯度,可以将大分子量的蛋白留在浓度相对较低的梯度,小分子量的蛋白达到相对较高浓度的梯度;不但能够更利于大分子量蛋白的转移,而且能让不同分子量的蛋白转移达到一定程度的契合

ACE生物公司的梯度预制胶产品具备良好的分辨率及稳定性,对样品的耐受程度高,更有独特的缓冲配方设计可以减少在托宾转膜缓冲液中胶体的发热情况。更可配合本公司专利技术的Fast Wet Transfer Gel Tank和Fast Transfer Buffer (20X)等产品使用,大于150 KD的蛋白条带亦可在30-40 min内完成湿式转印。

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