干货分享 | 传统手工制胶与预制胶的区别

一、SDS电泳技术

SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborne进一步完善。

SDS电泳技术是在变性条件下使用阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS通过包裹蛋白质来变性和展开蛋白质疏水部分。SDS以一定的比例结合蛋白质,形成的SDS-蛋白复合物是高度负电荷的,在电泳中此类复合物可依据其分子量大小分离它们。

聚丙烯酰胺和琼脂糖是两种常用于电泳的支持基质,支持基质为多孔介质,其行为类似于分子筛。分子的分离取决于凝胶的孔径及使用的支持基质。琼脂糖具有较大的孔径和非常适合分离大分子,如核酸和蛋白质-蛋白质复合物。聚丙烯酰胺具有较小的孔径和非常适合分离大多数蛋白质和较小的核酸。

电泳的缓冲系统是用连续或不连续的方法进行的。连续缓冲系统只使用一种凝胶缓冲液和运行缓冲液。不连续的缓冲器系统使用不同的凝胶缓冲液和运行缓冲液。这个系统也可以使用两个不同孔径和浓度的凝胶层以及不同的缓冲液组成(堆积胶,分离胶)。使用不连续缓冲系统的电泳可达到更高的分辨率。

含有单一浓度的聚丙烯酰胺凝胶称为固定浓度凝胶,聚丙烯酰胺凝胶浓度呈梯度范围的凝胶被称为梯度凝胶。使用梯度凝胶的优点首先是它可以分离比固定浓度凝胶分离范围更广的蛋白质,其次是它在转印方面有优势,它可以将分子量更大的蛋白分离在相对浓度较低的梯段,从而增加转印效率。

二、Laemmli体系(Tris-Glycine)的手工胶

通常Mini型手工聚丙烯酰胺凝胶在约8cm ×10cm的两块有支持物固定的玻璃板中灌制,玻璃板一块厚一块薄,合并厚度约为4mm,凝胶凝固后可以直接放置于电泳槽中运行。在灌制时通常使用6%-20%的固定浓度分离胶及4%的固定浓度浓缩胶。最常用的凝胶缓冲系统为Laemmli系统,其胶内缓冲体系为Tris-Cl体系,分离胶的PH值约为8.8,浓缩胶的PH值约为6.8,其电泳运行缓冲体系为Tris-glycine体系,PH值约为8.3,为典型的不连续缓冲体系。其作为蛋白分离的经典方法已使用多年,但是由于其局限性,它有如下不足。

①其分离胶的PH值为8.8,碱性条件,致使其保质期不会超过1个月。长时间放置丙烯酰胺会缓慢水解,导致分离介质变质,分离效果下降。此类凝胶只能短时间放置,现配现用为最佳。

②丙烯酰胺为神经毒性物质,虽然市场上通常以胶液形式出售,相较于粉状固体其配制时接触程度降低,但依然需要防护措施,特别是不慎滴于皮肤上时丙烯酰胺可经皮肤吸收,相对来说危险性较大。

③手工灌制凝胶基本为固定浓度胶,如果要灌制梯度胶,需要使用梯度混合仪,不仅操作复杂,而且无法保证批次的一致性。

④碱性条件对于一部分蛋白来说不能保证其稳定性,如需要保证样品条件需要更换中性缓冲体系。

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三、Bis-Tris的体系的预制胶

基于以上各点,另一种缓冲体系的预制聚丙烯酰胺凝胶作为商品化的产品在市场出现。

①其胶内缓冲体系为Bis-Tris体系,PH值为6.5-7.0。中性的缓冲体系,不仅可以保证绝大部分蛋白样品的正确展现而且可以大大延长聚丙烯酰胺凝胶的保存时间,此类凝胶的保质期通常在一年以上。相对于Laemmli系统此缓冲体系对蛋白的分辨能力更优秀。

②作为预制凝胶不再需要手工灌制,避免接触丙烯酰胺类毒性物质。

③作为商品化的预制凝胶具有不同的浓度和梯度可供选择,客户可以根据蛋白样品的情况自由选择合适的浓度和梯度,并且由于批量生产工艺稳定,可以保证凝胶产品的一致性。

④此类凝胶具有两套运行缓冲系统,分别为MOPS和MES运行缓冲液,相对来说MOPS运行缓冲液更适合展现10-250KD的蛋白条带。MES运行缓冲液更适合展现100KD以下的相对较小的条带,且MES较MOPS有更强的分辨能力。

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艾思易公司推出的Future PAGE™品牌预制胶,正是基于Bis-Tris的缓冲体系。具有优秀的分辨率和稳定性,避免您接触毒性物质,可以根据您的需要选择适合您样品的浓度梯度。更有独特的缓冲体系,可以耐受蛋白样品的杂质干扰。

 

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