ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit

一、产品介绍

BCA Protein Assay Kit是目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一。BCA蛋白质定量包括两步反应:首先,二价铜离子(Cu2+)在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子(Cu+);其次,两个分子的BCA络合一个一价铜离子(Cu+),形成一种在562 nm处有强吸收值的紫色复合物,而复合物的吸收值与蛋白的浓度在一定范围内呈线性相关(如图)。

ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit插图ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit插图1

使用BCA法进行蛋白质定量有以下特点:1.不受蛋白种类的影响,在20-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性。2.表面活性剂对浓度检测的干扰较小。但由于还原剂和螯合剂对反应有阻碍,因此本制品不适用于含有还原剂或者螯合剂的蛋白质样品的定量。

表1是试剂盒的基本组成,我们提供两种检测方案:试管和微孔板。试管方案所需样品量较大(0.1 mL),但样品和工作液的稀释比例为1:20(V/V),所以干扰物的影响比较小;微孔板方案所需的工作液较少(200 uL),样品体积少(25 uL),但样品和工作液的稀释比例为1:8(V/V),对干扰物的耐受较差。

ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit插图2

ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit插图3

 

二、操作步骤

1 .BSA 标准品稀释梯度

按照表 2 制备一组蛋白质标准品。最好使用与待测样品相同的稀释液,每个稀释浓度的标准品的体积足够用于三次重复检测。

ACE产品介绍 | BCA Protein Assay Kit插图4

2 制备 BCA 工作液

使用下述公式来确定所需的工作液的总体积:(标准品的个数 + 待测蛋白质样品的个数)×(实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积)= 所需工作液总体积;将 50 份 Solution A 与 1 份 Solution B 混合(A:B =50:1),制备工作液。

3 试管方案(样品与工作液的比例 =1:20)

①取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 0.1 mL,加入到做好标记的试管中;②在每个试管中加入 2.0 mL 工作液,充分混合;③将试管密封,根据不同实验方案,选择相应的温度和时间进行孵育:标准方案:37℃,30 min;增强方案:60℃,30 min;④将所有试管冷却至室温。⑤将分光光度计波长设定在 562 nm,用 I 管空白标准品对仪器进行调零(增强方案用 F 管空白标准品对仪器进行调零),然后在 10 min内依次检测所有样品的吸光值。⑥ 将 BSA 标准品在 562nm 处经过空白校正的吸光值对其浓度(μg/mL)作图,绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的浓度。

4 微孔板方案(样品与工作液比例 =1:8)

①取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 25 μL,加入到微孔板中;②在每一个孔中加入 200 μL 工作液,并在震荡器上震荡 30 s,使其充分混合;③将微孔板密封,在 37℃孵育 30 min;④将微孔板冷却至室温,使用酶标仪测量样品在 562 nm 处的吸光值;⑤将各个标准品和待测蛋白质样品在 562 nm 处的吸光值减去空白标准品在 562 nm 处的平均吸光值;⑥将 BSA 标准品在 562 nm 处经过空白校正的平均吸光值对其浓度(μg/mL)作图,绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的浓度

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