干货分享 | WB实验原理和步骤(一)

蛋白免疫印迹(Western blotting)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验技术方法。其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质样品进行分离,然后将经过分离后的蛋白质样品转移到固相载体上,固相载体可以非共价键形式吸附蛋白质,并且保持蛋白质的生物活性不变。以蛋白质作为抗原,利用相应的抗体对蛋白质进行免疫反应,再与酶或者同位素标记的第二抗体反应,经过底物显色或者放射自显影加以检测。

一、样品制备 

蛋白电泳的样品制备是指从细胞基质中提取和溶解蛋白样品,去除污染物(核酸、多糖等)以及将总蛋白浓度调节至合适的上样范围。样品制备的质量,是影响电泳结果和蛋白免疫印迹数据准确性的重要因素之一。

制备样品时,推荐使用物理和化学方法破碎细胞膜,确保细胞裂解和释放待检测蛋白。对于组织样本裂解产物,大多数情况下建议采用组织匀浆步骤,通常在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。裂解缓冲液中通常含有不同程度的去污剂、盐、酶抑制剂,用以裂解细胞,溶解蛋白,并防止降解。通常建议采用超声处理细胞和组织提取物。不同的超声仪器有不同的性能,应根据生产商的建议进行个性化优化,超声处理时应将样本置于冰上。一般来说,相较于细胞系提取物,细胞和组织初次提取物含有更多的背景条带和降解产物。使用新鲜、经过超声处理和离心的组织提取物可降低背景。此外,相较于标准裂解缓冲液,在去污剂含量高的RIPA缓冲液中裂解,会得到组织的更彻底和均匀的裂解物。

常见的样品制备:细胞样品、组织样品、体液样品

需要用到的仪器和试剂耗材:RIPA裂解液、PBS溶液、PMSF、蛋白酶抑制剂、匀浆机、均质仪、离心机等等

干货分享 | WB实验原理和步骤(一)插图

二、蛋白定量

蛋白定量是蛋白分离和分析前必须的一个重要步骤,蛋白色谱分离、蛋白质电泳分析、蛋白质免疫分离和分析、细胞裂解释放的总蛋白定量、蛋白分子的标记、蛋白结构分析等,都需要可靠的定量分析作为基础。蛋白定量分析应用的领域包括生物科学,食品检验,临床检验等等。

每种蛋白定量方法都有其局限性,而这取决于应用和分析的特定蛋白本身。在选择蛋白定量方法时,需要考虑的特性是:灵敏度(较低的检测限)、与样品中常见物质的相容性(例如,去污剂剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲等)、标准曲线的线性度和蛋白质间的差异。

常见的蛋白定量方法:BCA法、Bradford法、紫外法

需要用到的仪器和试剂耗材:BCA试剂盒、Bradford试剂盒、酶标仪、分光光度计等等

ACE相关产品:BCA Protein Assay kit 

产品亮点:蛋白标准品组分可常温保存,性价比高,同类产品价格最低

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三、上样前的处理

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,是分子去折叠,破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。蛋白的迁移率仅取决于蛋白质的分子质量的大小。

需要用到的仪器和试剂耗材:蛋白上样缓冲液、离心机、水浴锅、金属浴等等

ACE相关产品:4×LDS Loading Buffer

产品亮点:LDS中的十二烷基硫酸锂相比于十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白结合速度更快;且有两种指示剂,在绝大多数情况下最下缘的G250指示剂在5kd附近,传统的溴酚蓝在10kd,这样小分子也可以用;性价比高,同类产品最低价。

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四、蛋白电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常见电泳技术,用于分离蛋白质,并可精确测得蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺电泳具有分子筛效用。他有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在电泳过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而变性聚丙烯酰胺凝胶仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分离蛋白质。

需要用到的仪器和试剂耗材:电泳槽、电泳液、配胶试剂盒、配胶板子、梳子等等

ACE相关产品:Future PAGE™蛋白预制胶、MOPS-SDS Running Buffer

产品亮点:即开即用;安全无毒;节省时间;条带清晰;稳定性好;性价比高

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