干货分享 | WB实验原理和步骤(二)

前边我们介绍了WB实验原理盒步骤的前四步,包括样品制备、蛋白定量、上样前预处理和蛋白电泳。今天我们就继续聊聊WB实验后边的几步。

五、蛋白转印

电印迹技术一直是最常见的把蛋白质从凝胶转移到聚合物膜的方法。与其他早期技术相比,其主要优点是速度快以及能够保证转移的完整性。它可以通过以缓冲液完全浸入凝胶以及膜的“三明治”结构的湿式转印,也可以通过将凝胶和膜的夹层放置在浸泡过转移缓冲液的吸水介质之间进行转移的半干式转印来达成。

常见的蛋白转移方式:湿式转印,半干式转印

常见的转印聚合物膜:NC膜,PVDF膜

需要用到的仪器和试剂耗材:转印膜、转印滤纸、转印液、转膜设备等等

ACE相关产品:T-TRANS快速多通道半干转转印仪、Fast Transfer Buffer(20X)、S-TRANS快速转印试剂盒

产品亮点:转印效率高、性能优越、操作简单、节省空间、高通量

干货分享 | WB实验原理和步骤(二)插图干货分享 | WB实验原理和步骤(二)插图1

六、转印膜的封闭

封闭是Western Blot至关重要的一部分,转印成功后的膜片上有很多非特异性的蛋白结合位点,为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景,一般用惰性蛋白质或者非离子型去污剂封闭膜片上的非特异性蛋白质结合位点。Western Blot转膜时,PVDF膜在甲醇活化后是带电的,因而在转膜时会将蛋白吸附。封闭的目的就是将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满,以免孵育抗体的时候一抗二抗与之结合,产生非特异性条带或者背景杂乱。

需要用到的仪器和试剂耗材:BSA、脱脂奶粉、TBST、孵育盒、摇床等等

七、抗体孵育

 

抗体的孵育包含一抗的孵育和二抗的孵育。通常按照抗体说明书中推荐的稀释倍数,用封闭液稀释一抗,也可以采用不含封闭剂的1×TBST进行稀释。一抗孵育结束后,用TBST摇动洗膜数次,去除残留的一抗。通常按照抗体说明书中推荐的稀释倍数,用1×TBST稀释二抗。亦可用封闭剂稀释二抗,封闭剂可能会阻碍抗体与目标蛋白结合,从而在降低背景的同时导致特异性条带信号减弱。

需要用到的仪器和试剂耗材:实验用到的一抗和二抗、TBST、脱脂奶粉、孵育盒、摇床等等

八、曝光

一般使用的是发光液A和B分别为鲁米诺和过氧化氢,在辣根光氧化物酶(HRP)的催化作用下,鲁米诺和过氧化氢反应产生一种过氧化物,过氧化物不稳定会分解,形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态,就会产生荧光。

需要用到的仪器和试剂耗材:ECL工作液、化学发光仪、荧光扫描仪、孵育盒等等

ACE相关产品:ECL Basic、ECL Enhanced、ECL Super

产品亮点:性价比高,同类产品最低价

干货分享 | WB实验原理和步骤(二)插图2

You need to be registered and logged in to take this quiz. Log in